99 / 350
98
Εκδόσεις ΜΠΑΧΑΡΑΚΗ – Βιολογία Θετικών Σπουδών
Γ3.
Οι ανιχνευτές είναι ιχνηθετημένα μόρια DNA ή RNA που περιέχουν
αλληλουχίες συμπληρωματικές προς το κλωνοποιημένο DNA. Οι ανιχνευτές
αναμειγνύονται με το DNA της βιβλιοθήκης (το οποίο έχει αποδιαταχθεί) και
υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους DNA.
Μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχει έναν τεράστιο αριθμό από
κλωνοποιημένα κομμάτια χρωμοσωμικού DNA, τα οποία έχουν παραχθεί με
δράση κάποιας περιοριστικής ενδονουκλεάσης. Ορισμένα από τα κομμάτια
αυτά περιέχουν ολόκληρα γονίδια, άλλα περιέχουν κομμάτια γονιδίων και
άλλα τμήματα DNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Έτσι πρέπει μέσα από
όλα αυτά τα κομμάτια να εντοπίσουμε αυτό που θέλουμε να μελετήσουμε. Η
τεχνική που χρησιμοποιείται συνήθως περιλαμβάνει τη χρήση ιχνηθετημένων
ανιχνευτών μορίων DNA ή RNA που περιέχουν αλληλουχίες συμπληρωματικές
προς το κλωνοποιημένο DNA. Συνεπώς, οι διαδικασίες που θα ακολουθηθούν
προκειμένου ο ανιχνευτής να υβριδοποιήσει την κατάλληλη αλληλουχία DNA
είναι:
Αν επιδράσουμε στο DNA που απομονώθηκε με κατάλληλες χημικές ουσίες ή
αυξήσουμε τη θερμοκρασία τότε σπάζουν οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των
δύο συμπληρωματικών αλυσίδων και οι δύο αλυσίδες αποχωρίζονται η μία
από την άλλη. Η διαδικασία αυτή λέγεται αποδιάταξη
.
Οι δύο μονόκλωνες
συμπληρωματικές αλυσίδες σε κατάλληλες συνθήκες μπορούν να
επανασυνδεθούν. Στην ιδιότητα αυτή στηρίζεται η διαδικασία της
υβριδοποίησης που είναι η σύνδεση μονόκλωνων συμπληρωματικών
αλυσίδων DNA ή συμπληρωματικών DNA-RNA. Η υβριδοποίηση είναι μια πολύ
σημαντική ιδιότητα του DNA που μας δίνει τη δυνατότητα αν έχουμε ένα
γνωστό μόριο DNA, να το χρησιμοποιήσουμε ως ανιχνευτή για τον εντοπισμό
του συμπληρωματικού του όταν το τελευταίο βρίσκεται μαζί με χιλιάδες άλλα
κομμάτια. Τέλος, οι ανιχνευτές αναμειγνύονται με το DNA της βιβλιοθήκης (το
οποίο έχει αποδιαταχθεί) και υβριδοποιούν μόνο το συμπληρωματικό τους
DNA.
Ο κλώνος DNA που θα υβριδοποιηθεί είναι ο Ια (από το μόριο DNA I)
Κλώνος Ια :
5΄ TACCTC AAT CC GTATTA 3΄
Ανιχνευτής:
3΄ AGUUAGGCAU 5΄
Ο ανιχνευτής υβριδοποιεί την κατάλληλη αλληλουχία DNA με βάση τον κανόνα
της συμπληρωματικότητας και της αντιπαραλληλίας. Με βάση τον κανόνα της
συμπληρωματικότητας η αδενίνη του ανιχνευτή συνδέεται μόνο με θυμίνη του
κλώνου Ια, η Α του κλώνου Ια συνδέεται μόνο με U του ανιχνευτή, η γουανίνη
μόνο με την κυτοσίνη και αντίστροφα.
Επίσης, με βάση τον κανόνα της αντιπαραλληλίας το 3΄ άκρο του κλώνου Ια
(DNA) θα βρίσκεται απέναντι από το 5’ άκρο του ανιχνευτή και αντίστροφα.